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Plate-forme d'Exploration du métabolisme : des gènes aux métabolites

https://www.clermont.inra.fr/plateforme_exploration_metabolisme

Protéomique

Protocoles : préparation des échantillons

Remarques préliminaires :
• Faire si possible, les prélèvements sous hotte, aspiration éteinte, nettoyer la paillasse (éthanol) avant toutes manipulations,

• Pour limiter les contaminations par les kératines, manipuler avec des gants powder free, une blouse et éviter les vêtements en laine,

• Utiliser des tubes ayant été fermé dès ouverture du sac ou des tubes biopur Eppendorf

• NB : Si nécessité, nous acceptons des échantillons colorés à l’argent à conditions de réaliser une coloration compatible sans glutaraldéhyde (voir protocole donnée par liens).

I – Excision des spots

• Avant d’exciser les échantillons du gel d’électrophorèse, il est nécessaire de bien rincer le gel à l’eau MilliQ. Dans le cas d’échantillons provenant de gel 2D, les spots sont prélevés à l’aide de cônes de pipette découpés (faire l’excision le plus près du spot pour éviter un bruit chimique trop élevé en spectrométrie de masse). Pour les bandes (1D), le prélèvement se fait avec une lame de scalpel. Les échantillons sont ensuite placés dans des tubes eppendorf « low binding » de 0.5 ml ou dans des puits de plaque millipore (référence sur demande).

Les morceaux de gels peuvent être alors envoyés colorés ou décolorés (voir protocoles) pour analyse sur la plateforme (si possible dans un pli réfrigéré, en tout cas en livraison rapide).

Pour les échantillons colorés au nitrate d’argent, la décoloration est obligatoire avant envoi.

II – Lavage et décoloration (élimine le SDS et la coloration interférant lors de l’hydrolyse et/ou lors de l’analyse par spectrométrie de masse)

• II.1 – Lavage des spots ou bandes

• Ajouter 100µl de tampon bicarbonate d’ammonium 25mM -5% acétonitrile dans chaque tube ou puits contenant les spots et laisser incuber 30 min. Eliminer le tampon

• II.2 – Décoloration des spots ou bandes colorés au bleu de Coomassie (liens protocole de coloration)

• Ajouter 100µl de tampon bicarbonate d’ammonium 25mM - 50% acétonitrile dans chaque tube ou puits contenant les spots et laisser incuber 30 min sous agitations. Eliminer le tampon.

Répéter une deuxième fois cette étape de lavage.

• II.3 – Décoloration des spots ou bandes colorés au nitrate d’argent (liens protocole de coloration)

• Le nitrate d’argent est décoloré par une solution de 30 mM Potassium Ferricyanid-100 mM Sodium Thiosulfate (Ce mélange est préparé au dernier moment car il est instable à la lumière).

Ajouter 200 µl de solution par tube et laisser incuber 1 à 2 min, jusqu’à ce que la coloration à l’argent ait disparue. Eliminer ensuite cette solution de décoloration. Laver les spots avec deux bains successifs de 150 µl d’eau MilliQ, 15 min chacun (éliminer au maximum la coloration jaune). Ajouter 100 µl de tampon bicarbonate d’ammonium 25 mM - 50% acétonitrile dans chaque tube ou puits contenant les spots et laisser incuber 30 min. Eliminer le tampon.

• II.4 – Déshydratation des spots ou bandes

• Ajouter 200µl d’acétonitrile 100% et laisser 10 min pour déshydrater les morceaux de gels. L’acétonitrile est ensuite enlevé et les échantillons sont passés au Speed Vac pour éliminer l’acétonitrile restant.

Ils peuvent être stockés à – 20°C ou envoyés sur la plateforme pour analyse.

III – Digestion trypsique et extraction des peptides

• Il est possible de faire l’hydrolyse in gel et l’extraction des peptides en dehors de la plateforme. Mais pour des raisons de maîtrise du protocole de préparation des échantillons, nous préférons réaliser ces étapes dans le laboratoire d’analyse.